Metodolojik Karar Günlüğü

Karar: MACS, HALKSLE yerine HALDSLE tekrarları kullanacaktır.

Gerekçe: Hedeflenen pH-anahtarlama mekanizması Asp/Glu destekli histidin pKa mühendisliğine bağlıdır. Aspartat, 6.8 civarındaki hedef pH eşiğine yakın histidin protonasyon eğilimini artırabilecek yerel negatif bir elektrostatik ortam sağlar. Lizin pozitif bir yük getirecek ve histidin protonasyonuna karşı koyarak hedeflenen histidin fermuarı mekanizmasını zayıflatabilecektir.

Değerlendirilen alternatif: Daha önceki sekans dosyalarında ve AlphaFold girdisinde yer alan HALKSLE.

Yorumlama notu: HALDSLE çevresine atfedilen pH-anahtarlama işlevi bir tasarım hipotezi olarak kalmaktadır. Dizi düzeyindeki gerekçe ve hesaplamalı analiz deneysel doğrulamanın yerini tutmaz.

Karar: pH 6.8 için tüm histidinleri protonlamayın. PROPKA pKa değerlerine ve yapısal incelemeye dayanan seçici bir sınırda histidin seti kullanın.

Birincil pH 6.8 adayları: A:282, A:289, A:296, B:272, B:293, B:324, B:329, B:332.

Gerekçe: Bu kalıntılar hedef pH aralığına yakın PROPKA öngörülü pKa değerlerine sahiptir ve/veya yapısal olarak HALDSLE/arayüz bölgesine yakındır.

pH 7.4 kuralı: Kalıntıya özgü güçlü bir neden bulunmadıkça histidinler nötr kalacaktır.

Metodolojik not: AlphaFold modeli üzerindeki statik PROPKA hesaplamaları, çözeltideki dinamik ve çözücüyle etkileşimli pKa değerleri yerine sezgisel bir rehberlik sağlar.

Karar: pH 7.4 modelindeki tüm histidinler nötr HIE olarak atandı.

Gerekçe: pH 7.4, çoğu histidin için öngörülen pKa değerlerinin üzerindedir. Bu nedenle çift protonlanmış HIP kullanılmamıştır.

Değerlendirilen alternatif: Karışık HID/HIE tautomer ataması. Basitlik amacıyla ertelendi; bu model tekdüze bir nötr HIE ataması kullanır.

Metodolojik not: HIE/HID tautomer seçimi yerel hidrojen bağı ağlarını etkileyebilir, ancak nötr histidin topluluğu içinde ikincil bir varyasyonu temsil eder.

Karar: pH 6.8 topolojisi seçici HIP atamaları ile oluşturuldu: A:282, A:289, A:296, B:272, B:293, B:324, B:329, B:332. Diğer tüm histidinler nötr HIE olarak atandı.

Gerekçe: Seçilen kalıntılar, PROPKA ve yapısal incelemeye dayalı olarak sınırda pKa/arayüz/motif adaylarıdır.

Metodolojik not: Topoloji üretimi sonraki üretim örneklemesi aşaması için ayrık yük modelini kesinleştirmiştir.

Karar: pH 6.8 modeli, sekiz sınırda histidin için seçici HIP atamaları kullanır.

Gerekçe: PROPKA/Henderson–Hasselbalch analizi, bu kalıntıların pH 6.8'de pH 7.4'e kıyasla daha yüksek protonasyon eğilimine sahip olduğunu göstermektedir. Seçilen set için ortalama öngörülen protonlanmış fraksiyon pH 6.8'de pH 7.4'ten daha yüksektir ve bu durum pH'a bağlı bir protonasyon gradyanını destekler.

Değerlendirilen alternatif: Dinamik protonasyon/deprotonasyona izin verecek olan sabit pH'lı MD. Bu yaklaşım mevcut hesaplama ve yazılım kapsamının dışındadır.

Karar: Birincil üretim örneklemesi için (toplam ~600 ns) GROMACS 2026.1 kullanılarak hem pH 6.8 hem de pH 7.4 koşulları için 300 ns üretim TPR dosyaları oluşturulmuştur.

Kurulum sağlamlık kontrolü: Uzun üretim koşularından önce, her iki hazırlanmış sistem de EM/NVT/NPT hazırlığının ardından kısa bir yerel post-equilibrasyon sağlamlık kontrolünü tamamladı. Bu kontrol yalnızca belirgin kurulum kararsızlıklarını saptamak için kullanıldı; yakınsama veya mekanistik geçerlilik kanıtı olarak değerlendirilmedi.

Örnekleme yapısı: Birincil üretim örneklemesi, klasik sabit protonasyon koşulları altında her pH durumu (pH 6.8 ve pH 7.4) için yaklaşık 300 ns süren birer birincil yörüngeden oluşmakta ve toplamda yaklaşık 600 ns birincil örnekleme sağlamaktadır. Tamamlanmış bağımsız üretim kopyaları (replika) bulunmamaktadır. Yörünge uzunluğu konformasyonel keşif amaçlı örnekleme için seçilmiştir ve istatistiksel yakınsama anlamına gelmez.

Çıktı politikası: TRR çıktısı devre dışı bırakılmıştır. Yörünge depolaması için sıkıştırılmış XTC çıktısı kullanılmaktadır.

Karar: Modül A ile Modül B arasındaki eşleştirilmiş bir PB-MMPBSA uç-nokta karşılaştırması için her birincil üretim yörüngesinin son 100 ns'lik penceresini kullanın.

Yöntem: Son 100 ns'lik pencere (yaklaşık 200–300 ns), her pH koşulu için 100 ps kare aralığına sahip 1001 kare üzerinden analiz edildi. gmx_MMPBSA 1.6.5 ve AmberTools 23.6 PB çözücüsü kullanılarak Modül A reseptör, Modül B ise ligant olarak ele alındı.

Sonuç: Koşul başına 1001 kare genelinde, ortalama PB-MMPBSA ΔTOTAL değeri pH 6.8'de +61.43 kcal/mol (SD 59.38; SEM 1.88) ve pH 7.4'te +71.15 kcal/mol (SD 41.03; SEM 1.30) olarak hesaplandı. pH 6.8 − pH 7.4 ortalama farkı −9.72 kcal/mol oldu.

Yorum: Bu uç-nokta enerji modeli çerçevesinde, pH 6.8 topluluğu pH 7.4 topluluğuna kıyasla daha düşük bir ortalama Modül A–Modül B ΔTOTAL değerine sahiptir. Bu durum modellenen arayüz enerjilerinde pH'a bağlı bir farklılıkla yönsel olarak tutarlıdır.