Metodolojik Karar Günlüğü - MACS Araştırma Dokümantasyonu

Motif HALDSLE olarak kesinleştirildi

Karar (Decision): MACS, HALKSLE yerine HALDSLE tekrarları kullanacaktır.

Gerekçe (Reason): Hedeflenen pH-switch mekanizması Asp/Glu destekli histidin pKa mühendisliğine bağlıdır. Aspartat, 6.8 civarındaki hedef pH eşiğine yakın histidin protonasyon eğilimini artırabilecek yerel negatif bir elektrostatik ortam sağlar. Lizin pozitif bir yük getirecek ve histidin protonasyonuna karşı koyarak hedeflenen histidin fermuarı (histidine-zipper) mekanizmasını zayıflatabilecektir.

Değerlendirilen alternatif: Daha önceki sekans dosyalarında ve AlphaFold girdisinde yer alan HALKSLE.

Risk / sınırlama: pKa kayması (shift) bir tasarım hipotezidir. HALDSLE, PROPKA/H++ ve MD ile doğrulanmalıdır. Sadece tasarım sezgisine (intuition) dayanılarak doğru olduğu varsayılmamalıdır.

pH 6.8 histidin protonasyon aday seti

Karar: pH 6.8 için tüm histidinleri protonlamayın. PROPKA pKa değerlerine ve yapısal incelemeye dayanan seçici bir sınırda (borderline) histidin seti kullanın.

Birincil pH 6.8 adayları: A:282, A:289, A:296, B:272, B:293, B:324, B:329, B:332.

Gerekçe: Bu kalıntılar (residues) hedef pH aralığına yakın PROPKA öngörülü pKa değerlerine sahiptir ve/veya yapısal olarak HALDSLE/arayüz bölgesine yakındır.

pH 7.4 kuralı: Kalıntıya özgü (residue-specific) güçlü bir neden bulunmadıkça histidinler nötr kalacaktır.

Risk / sınırlama: AlphaFold modeli üzerinde statik PROPKA dinamik pKa kaymalarını yakalayamaz. Bu sabit protonasyonlu (fixed-protonation) bir yaklaşımdır, sabit pH'lı MD değildir.

pH 7.4 histidin ataması

Karar: pH 7.4 modelindeki tüm histidinler nötr HIE olarak atandı.

Gerekçe: pH 7.4, çoğu histidin için öngörülen pKa değerlerinin üzerindedir. Bu nedenle çift protonlanmış HIP kullanılmamıştır.

Değerlendirilen alternatif: Karışık HID/HIE tautomer ataması. Basitlik için ertelendi; bu model tekdüze (uniform) bir nötr HIE ataması kullanır.

Risk / sınırlama: HIE/HID tautomer seçimi yerel hidrojen bağlarını etkileyebilir. Bu, sabit protonasyonlu bir yaklaşım olarak kabul edilmelidir.

pH 6.8 topolojisi kesinleştirildi

Karar: pH 6.8 topolojisi seçici HIP atamaları ile oluşturuldu: A:282, A:289, A:296, B:272, B:293, B:324, B:329, B:332. Diğer tüm histidinler nötr HIE olarak atandı.

Gerekçe: Seçilen kalıntılar, PROPKA ve yapısal incelemeye dayalı olarak sınırda (borderline) pKa/arayüz/motif adaylarıdır.

Risk / sınırlama: Bu hâlâ sabit protonasyonlu bir modeldir. pH'a bağlı davranışı yaklaşık olarak hesaplar ancak sabit pH'lı MD'nin yerini almaz.

pH 6.8 için sabit protonasyonlu yaklaşım

Karar: pH 6.8 modeli, sekiz sınırda (borderline) histidin için seçici HIP atamaları kullanır.

Gerekçe: PROPKA/Henderson-Hasselbalch analizi, bu kalıntıların pH 6.8'de pH 7.4'ten daha yüksek protonasyon eğilimine sahip olduğunu göstermektedir. Seçilen set için ortalama öngörülen protonlanmış fraksiyon, pH 6.8'de pH 7.4'ten önemli ölçüde daha yüksektir ve bu durum pH'a bağlı bir protonasyon gradyanını destekler.

Değerlendirilen alternatif: Dinamik protonasyon/deprotonasyona izin verecek olan sabit pH'lı MD. Bu daha titizdir (rigorous) ancak mevcut hesaplama/yazılım kapsamının dışındadır.

Önemli sınırlama: Klasik sabit protonasyonlu GROMACS MD, kısmi protonasyonu temsil edemez. Bu kalıntıların HIP olarak atanması, bunların deneysel olarak pH 6.8'de %100 protonlanmış olduklarının bilindiği anlamına gelmez. Daha ziyade bu, pH'a en duyarlı HALDSLE ile ilişkili histidinlerin protonasyonunun hedeflenen konformasyonel anahtarı (switch) yönlendirip yönlendiremeyeceğini test etmek için kullanılan ayrık (discrete) bir yaklaşımdır. Herhangi bir raporda veya makalede, bu model pH 6.8'de tam fizyolojik protonasyonun doğrudan bir kanıtı olarak değil, sabit protonasyonlu bir yaklaşım olarak tanımlanmalıdır.

Yerel 1 ns doğrulama tamamlandı

Karar: Hem pH 6.8 hem de pH 7.4 sistemleri EM/NVT/NPT sonrası yerel 1 ns doğrulama MD'sini geçmiştir.

Sonuçlar: Her iki MD trajektorisi de başarıyla tamamlanmış, nihai koordinatlar üretilmiş ve standart doğrulama kontrollerinden geçmiştir.

Yorum (Interpretation): Sistemler daha uzun üretim MD'sine geçecek kadar kararlıdır.

Risk / sınırlama: 1 ns doğrulama yalnızca büyük (gross) kurulum kararsızlıklarını tespit eder. Uzun zaman ölçekli (long-timescale) yakınsamayı veya biyolojik doğruluğu kanıtlamaz.

GROMACS 2026.1 üretim TPR yenilenmesi

Karar: Nihai 300 ns üretim TPR dosyaları GROMACS 2026.1 ile yeniden oluşturulmuştur.

Sonuç: Hem pH 6.8 hem de pH 7.4 300 ns TPR dosyaları GROMACS 2026.1 ile başarıyla oluşturulmuştur.

Çıktı politikası: TRR çıktısı devre dışı bırakılmıştır. MD trajektorisi depolaması için sıkıştırılmış XTC çıktısı kullanılmaktadır.